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1、兴奋剂检测科普：怎么检测兴奋剂？北京冬奥会使用的“干血点”是啥？

作者： 谭骁天

北京冬奥会在精彩的比赛之外，也有一些不和谐的消息传来：

作为围观群众，你可能经常在与兴奋剂有关的新闻中听到“血检”“尿检”等字眼，但是，兴奋剂到底是怎么被检测出来的？在本届冬奥会中，北京冬奥组委会又使用了什么检测兴奋剂的新手段呢？

（图片来源：veer图库）

兴奋剂检测：色谱+质谱

经过与兴奋剂数十年的斗争，目前国际上对兴奋剂分子的检测、甄别技术已经越发健全了。虽然北京冬奥组委会尚没有公布本次奥运会检测兴奋剂的具体方法，但我们可以从历次大型体育赛事的常规检测方法中知晓兴奋剂检测的原理。

常规来讲，体育赛事中兴奋剂的检测大多是先将运动员生物样本中的各种分子萃取、分离，然后再依次确定这些分子“身份”。虽然从运动员身上取来的样品一般都是液体样品，如血液，尿液，汗液等，但在检测的过程中，实际上是分了气体、液体两条赛道的。

尿液是最常用到的检测标本，而血液样品主要用于检测那些一般不容易进入尿液里的分子，如生长激素、红细胞生成素等蛋白/糖蛋白类激素，以及外源性红细胞等可以提高在赛事中表现力的活性生物制品。尿液中一部分较容易挥发的分子（如一部分小分子类固醇类兴奋剂）会参加气体赛道的检测，而血液以及尿液中剩下的那些分子量比较大且表现较为“老实”的分子则会出现在液体检测的赛道中。

目前兴奋剂分析的大致流程

（图片来源：作者自制）

检测step 1——色谱分离不同分子

虽然赛道不尽相同，但在气体与液体赛道中不同分子的检测过程却殊途同归。这两种检测方式的第一步都是先将复杂样品中所含有的各种分子分隔开，让它们乖乖排队站好。

液相色谱/气相色谱技术

（A）典型的液相色谱结构示意图，其中横向柱状者为LC分离柱。（B）气相色谱结构简图，其中状如线圈者为GC分离柱。（C）一种以芯片式集成于硅片表面的微型GC分离柱。

（图片来源：维基百科（A）,参考文献1（B+C））

通过样品中不同分子的分子质量、所带电荷、亲疏水性等物理特征的区别，可以将不同的分子以一定的规律分开，这种方法被称为“色谱”（Chromatography）。这就好比让这些分子跑一个漫长的马拉松，然后通过漫长的路程区分出它们“耐力”的区别。

色谱的名字其实是源于百年前用碳酸钙从树叶提取物中分离不同植物色素的俄国植物学家米哈伊尔·茨维特（Михаил Семёнович Цвет）。相信这个实验，不少朋友在初高中生物课上就已经学习并体验过了（用滤纸从树叶汁中分离出叶绿素A，叶绿素B，叶黄素和β胡萝卜素）。但在今天，运用色谱技术来分离分子的物理特征中倒是很少包括分子颜色等光学特征了。

在现代色谱仪中用来分离分子的原件，叫做分离柱，现在一般被“生化环材实验狗”们称为柱子。一般来讲就是一根细长管道中填满了能与分子发生作用的填料。液相色谱(Liquid Chromatography, LC)中使用的柱子看起来较为短粗（长度一般不超过一米），而在气相色谱(Gas Chromatography, GC)中，由于气体分子与填料的相互作用较弱，分离不同分子所需的填料距离往往需要5-10米甚至更长。因为这个原因，气相色谱的分离柱看起来其实更像一团线圈。

一台比较典型的质谱分析仪

（ 图片来源：维基百科）

检测step 2——质谱仪验明正身

不管是样品中的液体分子还是气体分子，它们在通过色谱仪实现不同分子的分离之后，面临的下一道关卡都是能够给它们“验明正身”的质谱仪(MS)。质谱仪可以将色谱分离纯化后的分子进行电离，然后分析它们的“特征指纹”——质谱，从而确定这个分子的真实身份。

值得注意的是，目前在兴奋剂检测领域里有多种不同且常见的质谱技术，它们都有自己的独门绝技。例如主要用于检测痕量兴奋剂的DFS 高分辨双聚焦磁质谱和主要用于区分内源性和外源性睾丸酮的DELTA V 同位素质谱等（人工合成的睾丸酮往往具有更高的碳同位素一致性，而人体自己产生的睾丸酮分子内的碳原子会含有一部分C13或C14）。

说到睾丸酮，其实还有一段很惊险的旧事，就发生在我们非常熟悉的“不懂球的胖子”——刘国梁身上。1999年世乒赛上，刘国梁被查出血清表睾酮（一种睾丸酮变体）偏高，被怀疑是服用了外源性的兴奋剂，险些被禁赛。但实际上，他的血清睾丸酮水平异常是他自己的生理情况导致的（也许天生骨骼清奇？），并非服用兴奋剂。当时正是靠同位素质谱这一新技术以及国际乒联的多次飞行抽检，才让刘国梁洗清了冤屈。

虽然目前色谱+质谱(LC-MS/GC-MS)联用法仍然是兴奋剂检测的黄金标准，但其它一些技术也在这些年逐渐崭露头角。如基于微流控免疫分析的汗液中特殊分子（毒品、兴奋剂等）快检技术（可在20-30分子内完成测试），针对一些常见兴奋剂（如麻黄碱类）的ELISA免疫分析试剂盒，走电化学、毛细管电泳等技术路线的兴奋剂检测技术等等。

北京冬奥会：干血点技术首次正式使用

不光是检测技术，运动员样品的运输保存技术、样品提取技术对非法兴奋剂的有效检出也有很大的影响。

正如前文所说，传统意义上运动员的生物检材一般包括血液/血清以及尿液。为了防止尿样/血样中的兴奋剂分子被水解或在酶的影响下失活，样本的储存运输条件相当苛刻，比如，样本需要在冷藏（4︒C）的环境下尽快送检，而需要长期储存的样品则必须被维持在-20︒C之下。

2020年，国际兴奋剂检测机ITA还专门设立了一个用以长期储存样品的保存设施，可将运动员身上采集的各类标本保存十年以上。此外，样品运输到实验室之后，还需要经过比较复杂的萃取流程，在排除掉细胞与蛋白的干扰后，才能进入色谱/质谱检测的流程。

在三种不同滤纸上的干血点。血液滴在试纸上后会在30分钟左右的时间内逐渐干燥。但一般为保险起见，风干时间至少为2小时

（图片来源：参考文献2）

在经过东京奥运会的试验之后，北京冬奥会的兴奋剂检测流程中正式纳入了一种新的样本采集/运输技术——干血点（Dry Blood Spot, DBS）技术。其实这个技术说起来非常容易理解。就是将运动员的一滴血液（可为静脉血/指尖血）滴在滤纸（或硝酸纤维素膜）上，待其自然风干两三个小时即可制成。干血点技术并不是什么新技术，它曾在人类与艾滋病、乙型/丙型肝炎、疟疾等传染病的斗争中起到了很大的作用，尤其是在欠发达地区病人的样本采集活动中被广泛应用。

单纯针对兴奋剂检测而言，在干血点风干的过程中，不仅样品中兴奋剂小分子的浓度可以得到浓缩，同时血液中所含的细胞也会失水而死。由于没有了水和酶的干扰，干血点样品便非常稳定，可以在室温条件下保存数日乃至数周。也就是说，在未来的奥运会中，甚至可以不用携带保温设备，仅通过信封这种简单的封装方式就能运输样品。

与此同时，由于干血点样品中几乎不含水份，因此在使用甲醇等特殊有机溶剂时更有利于一些疏水性有机物的萃取。这些技术优点都有助于提高兴奋剂在后续气相色谱/液相色谱/质谱等测试中的检出能力。

结语

俗话说，道高一尺魔高一丈，即便是拥有了这么多反兴奋剂的先进技术和设备，还是有少数运动员会铤而走险服用兴奋剂。要想保证竞赛完全公平，仍然是一项非常难做到的任务，反兴奋剂还需要各方共同努力。

参考文献：

[1] Zhu, Hongbo. Development of Micro Gas Chromatographs and Micro Photoionization Detectors. Diss. 2019.

[2] Denniff, Philip, and Neil Spooner. "Effect of storage conditions on the weight and appearance of dried blood spot samples on various cellulose-based substrates." Bioanalysis 2.11 (2010): 1817-1822.

[3] Tretzel, Laura, et al. "Dried blood spots (DBS) in doping controls: a complementary matrix for improved in-and out-of-competition sports drug testing strategies." Analytical Methods 7.18 (2015): 7596-7605.

[4] Ramesh, Bokka, et al. "LC–HRMS determination of piperine on rat dried blood spots: A pharmacokinetic study." Journal of Pharmaceutical Analysis 6.1 (2016): 18-23.

[5] http://www.xinhuanet.com/politics/2016-02/27/c_128756864.htm

[6] http://wsjkw.hebei.gov.cn/html/zwyw/20220214/386104.html

[7] http://www.thermo.com.cn/Resources/200901/21111518394.pdf

[8] http://www.thermo.com.cn/e-newsletter/13/pdf/2-1.pdf

作者单位：京津冀国家技术创新中心

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2、兴奋剂检测科普，为什么兴奋剂检测如此严格

体育赛事可以说是和人类生活非常紧密贴切的了，每个人从小到大都离不开运动。但是只要有比赛就可能会产生作弊行为，而运动员在作弊方面查的最严的就是兴奋剂，不管是有意还是无意服用了兴奋剂都是零容忍。那为什么兴奋剂检测这么严格呢？ 如何判断运动员有没有服用兴奋剂？

在世界反兴奋剂机构列出的清单中共有11类禁用物质，和3类禁用方法。根据2018年的报告，其中最泛滥的禁药是促蛋白合成类固醇，它能代替身体中分泌的睾酮，激活细胞中的雄激素受体，让身体中的部分细胞增加蛋白质产量合成更多的细胞，让你肌肉发达获得敏捷和力量属性的加成。在这项研究中，服用类固醇的举重运动员在10周的训练中，比没吃药的运动员多长了4.2千克肌肉，他们的蹲举成绩提升了38%，已经比不吃药的运动员高出一个档次了。除了类固醇外人类生长激素等禁药也能提升肌肉量。根据2010年的研究，它能让运动员在百米短跑中的冲刺速度提升4%，而在里约奥运会的男子百米决赛中，冠军博尔特领先最后一名的幅度也只有2.5%而已。不过由于未经正规研究，许多兴奋剂的作用其实并不明确，比如促红细胞生成素简称EPO，就是一种常见的血液兴奋剂，它能增加体内血红细胞的含量，让身体给肌肉输送更多的氧气，提高运动员的耐力。这在长跑、游泳或自行车等项目中至关重要。但《柳叶刀》在2017年发布的这项研究却显示，EPO虽然提高了运动员的血红细胞浓度，和在实验室中能承受的最大运动量，但在总长130多公里的公路自行车赛中它却根本没有提升作用，而正是因为EPO，连续七年蝉联环法冠军的自行车手阿姆斯特朗，才身败名裂荣誉归零并终身禁赛。

总而言之，至少运动员们相信兴奋剂能让平庸的运动员突破天赋的障碍，让顶尖的运动员战胜更顶尖的对手，所以哪怕会遗臭万年伤害身心，也总有人愿意铤而走险，这正是兴奋剂检测如此严格的原因。那么，如何判断运动员有没有服用兴奋剂呢？

兴奋剂的检测方式一般以尿检为主，以血检作为补充，无论在场内场外运动员们都可能随时遭遇突袭，在采集至少90毫升尿样后，运动员需要在兴奋剂检察官的监督之下，将至少30毫升尿样导入A瓶，60毫升尿样导入B瓶，然后亲手封装好。检察官会对剩余尿样做尿比重（≥0.01g/cc）测定，只要符合要求这些样品就会被送进经过认证的兴奋剂检测实验室，其中A瓶用于分析，B瓶则冷藏保存备用。在实验室中，检测人员会根据具体项目检测A瓶样品中是否含有违禁物质，如果检测呈阳性，那还需要打开B瓶再做一次检测。在某些项目或赛事中，反兴奋剂机构还会对运动员做血检或血尿同检，这主要是针对一些尿检难以查出的禁药，但道高一尺魔高一丈，总有服药的运动员能够逃过检测，所以许多赛事要求样品要保存多年（10年）以备检查，比如2016年，国际举重联合会就在针对08年北京奥运会的复查中发现，有15名举重运动员的药检结果呈阳性，其中还包括数位金牌获得者。但这还不够，如果运动员间断服药或低剂量服药仍然很难被检出，所以国际反兴奋剂组织今年来又力推了一项新技术，运动员生物护照（ABP），生物护照分为两个模块，血液模块和类固醇模块，无论是否呈阳性，运动员每一次检测的血液和类固醇指标都会被记入护照，哪怕兴奋剂可以在短时间内代谢完，但它对身体的影响也是长期的，所以一旦指标有异常波动就说明运动员很可能服药了禁药。比如睾酮本身就是人体分泌的激素之一，所以睾酮制剂很难检测，而生物护照的类固醇模块中一个重要监测指标是睾酮和表睾酮的比值，也就是T/E比，虽然不同人的T/E比差别较大，但个体的T/E比相对稳定，如果运动员的T/E比出现明显变化，那就说明他很可能服用了睾酮制剂，也就是说即使没有直接检测到兴奋剂，生物护照也可以通过生物指标的纵向对比分析间接判断运动员是否违禁。伦敦奥运会男子50公里竞走的冠军谢尔盖，就是因为生物护照出了问题而被剥夺金牌。

从伦理上来看反兴奋剂不光是为了竞赛公平，更是要维护体育运动本身所传达的价值观，诚实、努力和健康，它们是所有人都珍视的精神，但这并不意味着所有人都认同现行的反兴奋剂规则，毕竟再高明的检测技术也不可能在新型兴奋剂之前出现。所以诚实的运动员总是吃亏的那一方，因此也有人提出，让所有运动员都在不伤害身体的情况下放开吃药，把身体机能发挥至极限或许反倒是更公平的做法。既然追求更高更快更强那就干脆贯彻到底，不过这种声音终究还是少数。

（图片来源于网络，如有侵权请联系我删除）

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