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1、abts法测总抗氧化能力实验步骤：微藻抗氧化超细纤维 王鑫航学习翻译

使用自由表面静电纺丝的微藻化合物开发的抗氧化超细纤维

摘要

自由表面静电纺丝是使用静电荷高产量生产非织造布的方法。该螺旋藻微藻是已知的蛋白质含量高，并呈现在商业上的重要性及其生物抗氧化剂，如藻蓝蛋白。这项研究的目的是开发基于螺旋藻 sp。的蛋白质浓缩物的抗氧化超细纤维。LEB 18 /聚（环氧乙烷）（PEO）和藻蓝蛋白，采用自由表面静电纺丝法。螺旋藻蛋白浓缩物的均匀超细纤维。含有2％（ww -1）藻蓝蛋白的LEB 18的直径为269,314和542 nm，分别为5,7.5和10％（ww -1））蛋白质浓度分别。电纺纤维增加了藻蓝蛋白的热稳定性。总的来说，螺旋藻sp。载有藻蓝蛋白的LEB 18 / PEO电纺纤维显示出抗氧化性能。因此，微藻生物化合物如藻蓝蛋白是开发生物活性超细纤维的创新替代品，可用于。

1 。介绍

静电纺丝是生产直径可控范围从几十纳米到几百纳米的超细纤维的有效方法（Su，Wu，Wang，Bao，＆Wang，2018）。自由表面静电纺丝是使用静电荷高通量生产非织造布的方法（Al-Deyab，El-Newehy，Nirmala，Abdel-Megeed，＆Kim，2013 ; El-Newehy，Al-Deyab，Kenawy，＆Abdel-Megeedet， 2012）。由于比喷丝板方法更高的生产量和更简单的管道，自由表面工艺对于大规模生产是理想的（Xiao＆Lim，2018））。由于其高表面积与体积比，可控形态和高孔隙率，电纺纤维可用于许多应用，包括控释和药物输送（Agarwal，Greiner，＆Wendorff，2009 ; Moreno，González-González，＆Romero-加西亚，2011年）。

由于化石资源的枯竭和对环境污染的关注，近年来已成为感兴趣的聚合物基质。迫切需要开发基于环境友好的天然来源的可再生聚合物材料，尤其是用于食品包装。例如，与淀粉相比，蛋白质具有更好的阻气性和更低的水蒸汽渗透性，因此它们可以用作基质来生产可生物降解的化合物（Kargarzadeh等，2019）。

微生物如微藻已被报道为新的蛋白质来源，因为其具有多种技术和商业优势，如高生长率，低成本生长条件，以及不与食品生产区域竞争（Chronakis＆Madsen，2011 ; Pereira，Lisboa， ＆Costa，2018年）。蛋白质被用作产生用于食品包装的功能性涂层的基质（Alehosseini，Gómez-Mascaraque，Martínez-Sanz，＆López-Rubio，2019 ），并且可以作为活性物质的载体，例如抗氧化剂，抗微生物剂和。然而，蛋白质水溶液倾向于高导电性。而且，由于的聚电解特性大分子削弱了纺丝原液的电荷密度，蛋白质水溶液的静电纺丝往往具有挑战性（ Huang，Zhang，Ramakrishna，＆Lim，2004）。因此，需要添加纺丝助剂，例如聚（环氧乙烷）（PEO）（ Moreira等，2018）。

研究表明，天然染料比合成染料更有效，因为它们没有毒性或致癌性（Dikshit＆Tallapragada，2018 ; Panesar，Kaur，＆Panesar，2015）。的螺旋藻微藻被称为其蛋白质含量高（65-80％，WW -1）（Morais的等人，2009。 ; Moreira的，特拉，科斯塔，＆Morais的，2016），包含在其生物质的商业重要性颜料，例如作为藻蓝蛋白。通常，藻蓝蛋白浓度达到微藻生物质中存在的总蛋白质的20％（Vonshak，1997）。藻蓝蛋白的商业利益可归因于其性质，例如充当天然染料，荧光标记和治疗剂（Martelli，Folli，Visai，Daglia，＆Ferrari，2014）。另一方面，纯净的藻蓝蛋白是氧，水分，热和光敏感的（Thangam等，2013 ; Yan，Liu，Jiao，＆Quin，2014）。因此，藻蓝蛋白在食品和/或包装中的应用受到限制（）。

为了克服这个问题，研究人员利用电纺纤维来增加生物化合物如藻蓝蛋白的稳定性（Braga等，2016）。布拉加等人。（2016）评估了藻蓝蛋白防腐剂的影响，发现纤维包封是保持色素对抗其他保存介质的最佳选择，例如使用如山梨糖醇和葡萄糖。

Romay，González，Ledón，Remirez和Rimbau（2003）报道，藻蓝蛋白的药理学和生理学重要性主要是由于其抗氧化和抗炎特性。然而，迄今为止，还没有关于从藻蓝蛋白开发和评价抗氧化超细纤维的报道，这可能有望用于以延长货架期。这项研究的目的是开发基于螺旋藻 sp。的蛋白质浓缩物的抗氧化超细纤维。LEB 18 /聚（环氧乙烷）（PEO）和藻蓝蛋白，采用自由表面静电纺丝法。

2 。材料与方法

2.1 。提取蛋白质浓缩物

螺旋藻藻。LEB 18是从巴西南部的Lagoa Mangueira分离出来的。将微藻生物质在烘箱中在50℃下干燥4小时，球磨（Modelo Q298，Quimis，Brazil），真空包装（Supervac400，Suplack，Brazil），然后在4℃下避光保存（）。

螺旋藻的蛋白质浓缩物。通过在40℃ 下将生物质溶解在pH 12（NaOH 1mol L -1）并以150rpm振荡，然后在25℃下以10,000× g离心15分钟来提取LEB 18 。将蛋白质浓缩物冷冻干燥以用于静电纺丝过程（）。

2.2 。聚合物溶液和静电纺丝参数

在5,7.5和10％（ww -1）来自螺旋藻属的蛋白质浓缩物中制备旋涂液。LEB 18和0.5％（ww -1 ）的聚（环氧乙烷）（PEO）（分子量900,000Da）（Sigma Aldrich，Canada）。将蛋白质浓缩物溶于：水（3：1，ww -1）中并在67±3℃下加热2小时（）。然后将聚合物溶液冷却至22±2℃并搅拌12小时。浓度为2％（ww -1 ）的藻蓝蛋白（Parry，Nutraceuticals，印度）在初步测试（数据未显示）中定义，显示为静电纺丝过程的最佳浓度。将该染料加入到溶液中并在25±3℃下搅拌6小时。还制备了不含藻蓝蛋白的聚合物溶液。使用电导率仪（Accumet XL20，Fisher Scientific，Canada）测定溶液的电导率值，并使用流变仪（Brookfield DV-III Ultra Programmable Rheometer，USA），使用1mL的每种样品测定粘度。

使用自由表面静电纺丝机（NS LAB，Elmarco，Liberec，Czech Republic）制备超细纤维。通过沿着线材来回扫掠（100mm s -1）的托架将旋涂液溶液沉积到带正电荷（50kV直流电）的固定线电极（300mm长度）上。用于沿着线释放溶液的孔直径为0.6mm，并且接地电极和线电极保持恒定电场的距离为180mm。旋转室保持在35±5％相对湿度和25±3℃。

2.3 。扫描电子显微镜（SEM）

使用溅射涂布机（Model K550，Emitech，Ashford，Kent，UK）用金（20nm）涂覆超细纤维。使用SEM（SEM S-570，Hitachi High Technologies Corp.，Tokyo，Japan）在10kV的加速电压下获得超细纤维的形态。通过从SEM图像测量50个不同点来确定纤维的平均直径，并用图像处理软件（Image Pro-Plus 6.0，Media Inc.，Bethesda，USA）分析。

2.4 。傅里叶变换红外光谱（FTIR）

在配备有衰减全反射（ATR）电池的傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪（IR Prestige-21，Shimadzu Corp.，Japan）中评价超细纤维。光谱记录在4000和650cm -1之间，光谱分辨率为8cm -1。对于每个光谱，共进行了32次扫描。使用Origin软件（OrginLab，USA）分析数据。

2.5 。热稳定性

使用热重分析仪（Shimadzu，DTG-60，Japan）根据ASTM D3850-12方法（ASTM，2013）测量超细纤维的热稳定性。分析在30℃至500℃，在惰性氮气氛中进行，流速为 30mL min -1 ，恒定为10℃min -1。

2.6 。抗氧化活性

在添加和不添加藻蓝蛋白的情况下，纤维的抗氧化活性评估如下。将约10mg超细纤维样品溶解在4mL碳酸氢盐/碳酸盐缓冲液0.2mol L -1（pH9.5）中，然后涡旋混合（AP-59，Phoenix，Argentina）10分钟。将样品在超声浴（Q3350，Quimis，Brazil）中超声处理15分钟，随后以12,800× g离心（Microcentrifuge 5410，Eppendorf，Brazil）30分钟。将上清液用于ABTS +和DPPH测定。

根据Miliauskas，Venskutonis和Van Beek（2004）进行ABTS +测定。将等份的3mL ABTS +溶液加入到30μL含有样品的溶液中。将溶液在室温下保持在黑暗中，并使用分光光度计（Q898DRM，Quimis，Brazil）在734nm处分析。使用等式（1）基于ABTS +自由基的减少计算抗氧化活性，其中A 样品是6分钟后样品的吸光度，A 对照是仅含有溶剂和ABTS +的溶液的吸光度。基。所有测量一式三份进行，并通过Tukey测试在95％的显着性水平下进行统计学评估（p <0.05）。

（1）ABTS+减少％=一个控制- 一个样品一个控制×100

的DPPH分析根据执行。将等份的3.9mL DPPH溶液（0.024g L -1）加入到0.1mL含有样品的溶液中。将溶液在室温下避光保存，并在分光光度计（Q898DRM，Quimis，Brazil）中在515nm处分析。基于等式（2）计算抗氧化活性，其中A 样品是10分钟后样品的吸光度，A 对照是仅含有具有DPPH基团的溶剂的溶液的吸光度。所有测量一式三份进行，并通过Tukey测试在95％的显着性水平下进行统计学评估（p <0.05）。

（2）DPPH抑制（％）=一个控制- 一个样品一个控制×100

3 。结果和讨论

3.1 。超细纤维的形态和直径

纤维的形态受溶液性质的影响，尤其是导电性和粘度。增加聚合物溶液的粘度可以通过聚合物链的缠结来稳定射流来减少液滴和珠子的形成（Uebel等，2016）。添加藻蓝蛋白和增加螺旋藻的蛋白质浓度。LEB 18导致聚合物溶液的电导率和粘度增加（表1），而不影响超细纤维的均匀性。因此，在两种蛋白质溶液（含有和不含藻蓝蛋白）中都存在电导率以建立电荷排斥（排斥力）以克服液滴的表面张力以形成纤维射流（ ; Ramakrishna，Fukihara，Teo，Lim，＆Ma et al。，2005）。

此外，当螺旋藻的蛋白质含量时，观察到纤维直径的增加。LEB 18或藻蓝蛋白含量增加。根据Sun等人的说法，纤维直径的增加可能是由聚合物溶液的粘度增加引起的，这使得难以拉伸纤维。其他研究还观察到通过增加聚合物浓度来增加平均纤维直径（Moomand＆Lim，2014 ; Verdugo，Lim，＆Rubilar，2014）。Figueira等报道了类似的纤维形态和直径（295nm），研究了载有藻蓝蛋白（3％，wv -1）的静电纺PEO（6％，wv -1）纤维。

在最高的螺旋藻 sp。与使用较低蛋白质浓度制备的那些相比，观察到LEB18蛋白质浓缩物浓度（10％，ww -1），直径均匀性较差的纤维（图1）。在这种情况下，发现在425nm（图2a）与藻蓝蛋白的相对频率为18％，在没有该染料的情况下在375nm处的相对频率为16％（ 2b）。使用7.5％（ww -1）的蛋白质和添加藻蓝蛋白，频率在325nm处为44％（ 2c），并且在275nm处没有颜料为33％（ 2d）。超细纤维直径的相对频率以5％（ww -1蛋白质在275nm处为39％（2e），在225nm处为68％（ 2f），分别添加和不添加藻蓝蛋白。直径较小的尺寸和频率的这种行为可以有助于促进来自超细纤维的生物活性材料。

在我们之前的研究中发现了类似的频率，当时我们研究了微藻蛋白浓缩物和PEO（0.8％，ww -1）加热对电纺超细纤维发展的影响（）。当PEO在溶液中加热时，我们在用5％蛋白质制备纤维时观察到直径为110nm的相对频率为36％。当加入PEO而不加热时，发现直径为42％的相对频率为225nm。

根据Vega-Lugo和Lim（2008），添加PEO（一种柔韧的长链聚合物）可与分离相互作用，降低浓缩蛋白质溶液的电导率。结果，聚合物射流表面上增加的电荷密度增强了纤维形成过程中溶液的伸长率。来自微藻来源的蛋白质浓缩物溶液中加入PEO的细小，长而均匀的纤维可能与这种现象有关。

3.2 。傅里叶变换红外光谱和热稳定性

电纺纤维的FTIR光谱（图3）显示在1650cm -1（C = O拉伸）和1535cm -1 （NH拉伸）下的强吸收，这是蛋白质和藻蓝蛋白的特征性 I和II带。样品。这与Patel，Mishra，Pawar和Ghosh（2005）的结果一致，他们报告了螺旋藻，Phormidium和Lyngbya spp的纯藻蓝蛋白的峰值。在1655cm -1和1543cm -1处，分别对应于酰胺基团I和II。

3300cm -1附近的吸收带归因于OH基团的伸长振动。此外，在1241cm -1处观察到对应于CN伸长的吸收带。在用藻蓝蛋白和不同蛋白质浓缩物浓度开发的样品中发现了所有吸收带。该结果表明蛋白质，藻蓝蛋白和PEO之间存在相互作用，可能是由于蛋白质二级结构的改变（Liu＆Ma，2016）。

含有和不含藻蓝蛋白的纤维的热降解曲线显示出相似的曲线（图4）。观察到热重分析曲线中两个明显的重量损失阶段。第一个温度范围（30-160°C）对应于样品中的水分蒸发和蛋白质变性（Li-Chan＆Ma，2002）。在第二阶段，纤维的初始降解温度（T i）约为220-240℃，这是蛋白质的特征分解温度（）。

在213.2℃下检测到纯藻蓝蛋白的T i。对于使用5,7.5和10％（ww -1）蛋白质的旋转涂料溶液制备的纤维，添加藻蓝蛋白的超细纤维的T i分别高于颜料246,243和222℃的Ti。浓缩。根据说法，藻蓝蛋白对热不稳定，因此其在需要热处理的食品中的应用潜力受到限制。鉴于藻蓝蛋白的稳定性增加，来自螺旋藻的电纺蛋白浓缩超细纤维。LEB 18可以有希望提高颜料的热稳定性。

在另一项研究中，Fernandez，Torres-Giner和Lagaron（2009）报道了另一种抗氧化剂化合物在玉米醇溶蛋白的超细纤维中成功包封，提供了良好的抗氧化保护作用，并显着提高了包封组分的光稳定性。因此，除了热稳定性之外，基于来自螺旋藻 sp。的蛋白质浓缩物的超细纤维。LEB 18 /聚（环氧乙烷）（PEO）可被认为是有希望的材料，有助于藻蓝蛋白对水分，氧气和光等参数的稳定性。

3.3 。超细纤维的抗氧化活性

总体而言，与不含颜料的超细纤维相比，载有藻蓝蛋白的电纺纤维具有更高的抗氧化能力（）。含有藻蓝蛋白的纤维平均显示出ABTS +和DPPH自由基分别减少29.7％和5.3％的抑制。开发了含有姜黄素的超细纤维，并观察到ABTS +自由基减少35.5％的类似结果。

基于ABTS +自由基变色的抗氧化活性测定被广泛用于评价亲脂性和亲水性样品对自由基的抑制的抗氧化能力（Kong＆Xiong，2006）。以这种方式，ABTS +方法抗氧化活性获得的更高结果表明超细纤维作为生物活性材料用于食品包装的潜力。

根据Sonani等人的说法，通过DPPH自由基抑制能力评估的藻蓝蛋白的抗氧化活性取决于所用的剂量。这可以解释与ABTS + 方法相比在DPPH测试中获得的较低结果。此外，由于包封通常倾向于保护（例如，蛋白质，抗氧化剂，抗微生物剂和维生素）（Mascheroni等人，2013），因此在抗氧化剂评估期间生物活性化合物的总释放可能受到阻碍。

纤维中的包封对藻蓝蛋白提供了更大的保护作用（），而不是在暴露于光和温度和氧气等恶化因子的食物中。固定在聚合物结构的间隙中的藻蓝蛋白倾向于以受控的方式在食物中释放，同时保持产品的感官特性（）。

抗氧化剂化合物可通过氢原子或电子的作用抑制或阻止自由基氧化，氢原子将自由基转化为稳定的物质（Wojcik，Burzynska-Pedziwiatr，＆Wozniak，2010 ）。因此，使用抗氧化超细纤维用于食品包装是一种创新的替代品，可提供去除自由基，延长，避免变质的能力。根据Alexis，Pridgen，Langer和Farokhzad（2010）以及Zhang，Zeng和Li（2013），纳米技术涉及材料的控制，因此超细纤维的使用可以增强全部或部分应用的植物化学物质的分布在食品中。

4 。结论

使用来自螺旋藻的 7.5％（ww -1）蛋白质浓缩物开发具有平均直径为314nm的抗氧化活性的静电纺纤维。LEB 18，含有2％（ww -1 ）的藻蓝蛋白。该纤维可用于食品工业，例如保护氧敏感产品和开发。此外，电纺纤维可在热加工过程中潜在地保护藻蓝蛋白，并充当控制释放该的载体。

2、abts法测总抗氧化能力实验步骤，五种总抗氧化能力检测方法的简介及对比

总抗氧化能力简介

氧化应激是体内产生的自由基超出了机体抗氧化清除的能力，引起细胞和组织氧化损伤的一种状态。防御氧化应激，主要依靠机体内的抗氧化体系。

根据清除机制的不同，抗氧化体系大致可分为两个系统：酶抗氧化系统和非酶抗氧化系统。每一个系统都存在多种物质。

氧化应激的产生与检测

体系内各种抗氧化大分子、小分子和酶的总水平，反映了该体系内的总抗氧化能力（T-AOC）。T-AOC能更全面地评价体液、细胞和组织匀浆、食品和饮料的抗氧化剂含量，广泛应用于医学、食品科学等相关研究。

02 总抗氧化能力的检测方法

a 铁离子还原抗氧化能力测定法（FRAP法）

FRAP法（ferric reducing antioxidant power），即在酸性条件下，Fe3 -TPTZ被样本中的抗氧化物质还原为蓝色的Fe2 -TPTZ，并在593nm波长处产生特征吸收峰。以Fe2 为标准，通过吸光度的大小，可以计算样本的抗氧化能力。

FRAP法测定步骤简单，速度快，但其本质是以Fe2 进行等量替代的计算方法，反应本身并不具备抗氧化能力的生物学相关性。

b 菲啉法

样本中的抗氧化物质能将Fe3 还原成Fe2 ，后者与菲啉类物质形成稳定的橙红色络合物，在520nm波长处产生特征吸收峰。通过测定吸光度的变化量，可以计算出抗氧化物质的还原能力。

该方法测定的最终结果以活性单位方式表达，便于与其他生理指标进行对比。但其特征吸收波长与部分样本及抗氧化剂的吸收波段有重叠，需要进行对照试验。

c ABTS法（TEAC法）

ABTS[2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]法，又称TEAC（trolox equivalent antioxidant capacity）法。ABTS与适当氧化剂作用后，会生成蓝绿色的ABTS阳离子自由基（ABTS• ），在734nm波长处产生特征吸收峰，当抗氧化物质存在时，ABTS• 的生成会受到抑制，使吸光度降低。与Trolox标准对照体系相比较，就能计算出样本的总抗氧化能力（TEAC值）。

ABTS法操作简单，结果重复性较好，非常适合实验室的分析检测，对水溶性和脂溶性抗氧化剂都适用，适用于大批量生物样品（包括血清在内）、果蔬类、部分纯物质等样本的体外抗氧化能力测定。

d 二苯基苦基苯肼（DPPH）法

DPPH•是一种稳定的氮中心显色自由基，在517nm波长处产生特征吸收峰。样本中的抗氧化物质会使DPPH•的吸光度减小直至消失，其吸光度的变化量在一定区间内与抗氧化物质含量呈线性关系。

DPPH法快速、简单，但其检测波长与部分抗氧化物质本身的吸收波段重叠（如类胡萝卜素）。因此，在检测该类物质时，结果会有一定偏差。

e 氧化自由基吸收能力测定（ORAC）法

ORAC（oxygen radical absorbance capacity）法测定氧化自由基的吸收能力，以AAPH为自由基来源，荧光素（SF）为指示剂，Trolox为定量标准。

荧光素受到自由基攻击后，荧光强度会持续衰减；抗氧化物质对自由基的吸收作用，能延缓荧光素的衰减速率。通过荧光分析仪，对荧光衰减曲线下面积（AUG）进行定量分析，可以计算样本的自由基清除能力。

ORAC提供的自由基与生理过程中的自由基具有高度一致性，具有较高的特异性。但其所需实验仪器较为昂贵，且对温度和荧光标记物要求较高，操作难度较大。

03 总结

总抗氧化能力的评价方法，因检测原理、反应条件等的不同而多种多样，每一种方法都有其适用范围和特点。

目前，还没有哪一种方法能够全面地评价出样本的总抗氧化能力。实验中，往往需要至少两种方法同时测定。对于具体样本，应根据分析条件和作用底物等因素，综合选择相应的检测方法。

以上五种方法中，DPPH法、FRAP法和 ABTS法较为简便易行，但DPPH、ABTS的化学性质使其偏离生物环境较远；FRAP法和 ABTS法在结果上具有很好的相关性与一致性，尤其是在成本和操作上，具有明显的比较优势。

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