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1、细胞周期分析是查什么：细胞周期的检测方法

细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反映了细胞增殖速度。细胞周期是一个重要的检测参数，研究细胞周期变化的影响对于肿瘤的发展及药物研发有着重要的作用。例如，已知抑制有丝分裂的化合物大都用来减缓肿瘤细胞的生长。

细胞周期内有两个阶段最为重要：G1 到 S 和 G2 到 M；这两个阶段正处在复杂活跃的分子水平变化的时期，容易受环境条件的影响，如果能够人为地进行调控，将对深入了解生物的生长发育和控制肿瘤生长等有重要意义。能够方便有效地检测细胞周期的变化，对于药物研发和疾病研究等都具有重要的意义。

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

那么，细胞周期的测定如何进行的呢？测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、流式细胞仪法、基于细胞成像的荧光检测法等。

一、同位素标记法测定细胞周期

标记有丝分裂百分率法 (PLM) 是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。

测定原理：

① 待测细胞经 3H- 胸腺嘧啶核苷标记后，所有 S 期细胞均被标记。
② S 期细胞经 G2 期才进入 M 期，所以一段时间内 PLM = 0。
③ 开始出现标记 M 期细胞时，表示处于 S 期最后阶段的细胞，已渡过 G2 期，所以从 PLM = 0 到出现 PLM 的时间间隔为 G2期的持续时间。
④ S 期细胞逐渐进入 M 期，PLM 上升，到达到最高点的时候说明来自处于 S 最后阶段的细胞，已完成 M，进入 G1 期。所以从开始出现 M 到 PLM 达到最高点 (≈ 100%) 的时间间隔就是 M 期的持续时间。
⑤ 当 PLM 开始下降时，表明处于 S 期最初阶段的细胞也已进入 M 期，所以出现 LM 到 PLM 又开始下降的一段时间等于 S 期的持续时间。

二、流式细胞仪 PI 染色法

细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期：即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 与 DNA 合成后期 ( G2 期 )。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行一定生物学功能 ( G0 期 )。

检测细胞周期的原理：

由于细胞周期各时相的 DNA 含量不同，通常正常细胞的 G1 / G0 期具有二倍体细胞的 DNA 含量 ( 2N )，而 G2 / M 期具有四倍体细胞的 DNA 含量 (4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。PI可以与 DNA 结合，其荧光强度直接反映了细胞内 DNA含量。因此，通过流式细胞仪 PI 染色法对细胞内 DNA 含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为 G1 / G0 期，S 期和 G2 / M期，获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。

三、基于成像的荧光检测法

FUCCI (fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator) 小球能鉴别细胞处在细胞周期的哪一时期，因此可以用来研究癌症细胞周期的进程。FUCCI 技术建立在鉴定过表达的两种调节细胞周期的蛋白 geminin 和 Cdt1 水平上，其中 geminin 融合的是绿色荧光基团 AmCyan，而 Cdt1 融合的是红色荧光基团 mCherry。Cdt1 和 geminin 的水平随着细胞周期的变化而不断波动：Cdt1 蛋白水平在 G1 阶段达到峰值，而 geminin 蛋白水平在 S，G2 和 M 期不断升高。这一结果体现为表达 FUCCI 细胞核在G1 期为红色而在 S，G2 和 M 期则呈现绿色 ( 图 2 )。

1 检测方法

A375S FUCCI 球体准备的方法如下：Corning 公司 96 孔 U 型底低吸附细胞培养板中加入含有 EGF (20 ng / mL) 和 B27 (1×)的 DMEM / F 12 培养基，按每孔 1,000 细胞进行种板。细胞板离心 (800 g,6 min) 后在 37 ℃，5% CO2条件下进行孵育。最后，用含 10% FCS 的培养基清洗球体 3 次以移除 EGF 和 B27，继续培养 1 至 6 天。

2 数据分析

MiniMax 细胞计数仪的透射光模块可以从自动聚焦得到更好的图像效果。SoftMax Pro 软件中的“Field Analysis”能进行自定义分析从而鉴别细胞重叠的部分。我们应用一种特殊的鉴别方法来区分目标球体和其余物体，如残渣和个体细胞，从而在后续的分析中予以去除 (Figure 2, A and E)。最后，我们选择感兴趣的区域并从图像中去除不想要的物体。在绿色和红色荧光通道中，球体可以通过“Object Count”模式中大小和与背景相对荧光强度的区别被轻易的筛选出来 (Figure 2, B-D, F-G)。然后运用SoftMax Pro 软件计算图像的“% Area coverage”和球体的“Object Area” (μm2)。图像的获取和分析的设置方法见表 1。

3 结果

SoftMax Pro 软件中获取及分析的设置可以在绿色和红色荧光通道的透射光下简便快速地分辨每个孔中的单球体。SoftMax Pro软件还可计算所有通道包含的面积占比和物体面积 (μm2) (图 3，表 2)。在绿色和红色荧光通道下可以获得最好的结果。对于 FUCCI 球体来说，图 3 中红色部分展示的是光滑圆润的球体而绿色部分则在细胞表面，说明球体内部的细胞处在 G1 期而表面细胞即将进入 M 期。对应软件可以分辨球体大小和形状 ( 球形参数 ) 的各种变化，因此常用来研究多种处理，如抗癌药物，对细胞增殖的影响 ( 图4 )。MiniMax 中绿色和红色荧光的光学成形功能可以将 3D 图像转换为 2D 投射球体图。

四、高内涵检测法

方法

1. 准备细胞悬液，40,000 细胞 / mL 的 Hela 细胞悬液与 30 颗粒 / 细胞浓度的 FUCCI 试剂混合，以 4,000 细胞 / 孔的浓度种在 96 孔板中，孔板置于 37 °C，5% CO2 的环境下贴壁 8 小时。
2. 不同浓度的有丝分裂抑制剂处理细胞，然后孔板放入 ImageXpress Micro 系统。
3. 每隔 2-3 小时系统自动拍摄一次图片，使用 20 倍 Plan Apo 物镜，同时获取明场及两个荧光通道 FITC 和 TRITC 的图像。实验持续 48 - 72 小时，细胞可完成 1 - 2 次分裂。
4. 分析延迟实验图像使用 MetaXpress® 高内涵成像与分析软件的用户自定义模块。

Premo® FUCCI 细胞周期指示剂结合配置环境控制的 ImageXpress Micro 高内涵成像系统和 MetaXpress 高内涵分析软件，可实现高效的活细胞周期精确测量。高通量筛选技术可为科学家提供一个快速、自动的基于图像定量分析细胞周期的方法，并能够完整地记录长时间内的细胞周期变化。另外，MetaXpress 软件能够在明场图像识别细胞，避免了染料对活细胞的毒性。同一标准具有统计学意义的定量分析方法可评价多化合物在不同浓度对细胞周期影响的相关参数。

2、细胞周期分析是查什么，史上最详细MDS异常细胞形态解读笔记

黄兴琴 | 陆军军医大学西南血液科实验室

WHO对骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome ，MDS）的定义

是一组克隆性造血干细胞疾病，其特征是血细胞减少，髓系细胞一系或多系发育异常，无效造血，以及演变AML的风险增高。

细胞形态学是MDS诊断的基石和灵魂。

MDS形态国际工作组于2016年对MDS的形态学异常文字描述很多，许多初学者对于发育异常细胞和正常细胞的把控有所欠缺，特将粒、红、巨三系形态学发育异常制作一表格并加以详细解读。

造血细胞发育异常（dysplasia）

(所有采图均来自确诊MDS患者)

1 粒细胞生成异常（dysgranulopoiesis,dysG）

A 假性Pelger-Huet畸形

主要是分叶不良。一种是单个核，不分叶,核固缩明显（纯合子有关）；分叶减少,两叶为主，呈花生样核、眼镜核、哑铃型核（多与杂合子有关）。与真性Pelger-Huet畸形鉴别：后者整个涂片基本无核分叶现象，核叶1-2个。

B 巨大分叶核中性粒细胞、不规则核多分叶

细胞体积至少达到正常分叶核中性粒细胞大小的2倍，且非生理性的多分叶，胞体大，胞核大，MA时胞体、浆、核均大，可以通俗理解为不和谐的臃肿者与唐朝匀称的胖美人给人的感觉吧。

C 细胞核棒槌小体

一个核上见到4个以上棒槌小体，核突起，且非性染色体相关。

D 异常染色质凝集

染色质聚集成大块状，有清亮区分隔，似凋亡的细胞核，核质变性。中晚幼粒有时显得比较小。

E 双核中晚幼粒：

胞体较大，双核多不对等，核染色质异常分化所致。

F 异常原粒

体积可大可小，部分多颗粒，颗粒＜20颗定义为原粒II型，颗粒＞20颗但是无可见的高尔基区，定义为原粒III型，和早幼粒细胞进行鉴别。小原粒更多见，且成双成对出现，如影随形。双核原粒多提示恶性，染色体可能为多倍体。偶有畸形核或数量不等的空泡。

G MDS之异常早幼粒细胞

此非M3的异常早幼粒细胞，区别在于前者核形清楚，核染色质细颗粒状，胞浆颗粒大小不一，分布不均匀，有颗粒聚集感，胞质染色蓝色但是有深有浅不匀。M3的异常早幼粒细胞核形蝴蝶或者臀样不规则，可见核出芽，内外浆明显，颗粒覆盖全核或内浆充满颗粒，典型者整体细胞如同一个降落伞外形。

H 胞浆颗粒减少或缺如

胞质颗粒减少至少达到正常中性粒细胞颗粒的2/3。

I 核浆发育失衡

MDS之中幼粒可见内外浆多伴颗粒减少，也可见朝阳红或黄沙洋颗粒，但是不同于M2b的异常中幼粒细胞，后者可见内外浆，胞浆易见空泡，核形多异常，多伴有嗜酸增高，易见Auer小体，下阶段晚幼或成熟粒细胞也可见到Auer小体。

J Auer小体

异常原粒胞浆可见紫红色棒状物。

K 杜勒小体

胞浆类似墨水沾染的嗜碱性物质，实质是发育不良的胞浆成分。

L 假Chediak-Higashi颗粒

紫红色或紫黄色的类圆形颗粒，原始细胞胞浆里体积较大，多圆形规则，大小不等的包涵体样物质。

M 环状核、电风扇样的三叶状核、巨幼样变核

2 红细胞生成异常（dyserythropoiesis,dysE）

A 外周血

成熟红细胞大小不一，巨大红细胞增多（直径>2个正常红细胞直径），可见椭圆形大红细胞、嗜多色性红细胞、点彩红细胞及有核红细胞。

B 核间桥

核与核之间的细丝相连，可以是一个细胞内的两个核之间核丝相连，也可以是两个细胞的核之间细丝相连，如同两个圆石墩之间的独木桥。不是胞间桥，胞浆成分以丝相连，在正常贫血患者骨髓极易见。

C

核出芽：单个芽或多个出芽。

母子核：较多见。

大小核：一个细胞内的两个胞核之间大小不同，如兄弟核，核成熟程度不一样。

核多分叶：核多分叶形似花瓣样畸形。

核碎裂：细胞核固缩引起的核解体，大部分核呈现一个大的椭圆形核结构，旁边是大大小小的碎裂核物质，染色相同。出现率较低。

核形不规则，含H-J小体。

D 多核红

双核：含有两个细胞核的幼红细胞。

多核，尤其奇数核意义大，3核5核等。

E 核膜断裂现象

核的膜不完整，某处如同豁口，中幼红多见。

F 核的幼巨红细胞样改变

体积显著大于正常的幼红细胞，胞核多分叶状，核染色质不均一，有深有浅，复制异常所致，以晚幼红为主，巨中幼红较少见，而MA核浆整体都变大，核染色质烟丝感，中巨幼红多见，有利于二者区别。

G 胞浆空泡

体积显著大于正常的幼红细胞，胞核多分叶状，核染色质不均一，有深有浅，复制异常所致，以晚幼红为主，巨中幼红较少见，而MA核浆整体都变大，核染色质烟丝感，中巨幼红多见，有利于二者区别。

H 束腰核

一个核，两侧中央凹进去犹如哑铃，不是两个核连在一起。

I PAS阳性

糖原聚集，反应红系高度增生和发育异常的恶性本质。

J 环形铁粒幼红细胞

铁粒≥5个以上且围绕核周排列1/3以上，或以任何形式比较有规则的绕核排列者（环状或半环）。（IWGM-MDS）

3 巨核细胞生成异常（dysmegakaryocytopoiesis,dysMK）

A 小巨核

直径多25-40um，细胞面积<800um2，包括淋巴样小巨核和小圆核小巨核。小巨核单核、双核或多核可见。

B 微巨核

即淋巴样小巨核，类圆形，5-8um，细胞核质比大，核染色质浓集，结构不清，无核仁，细胞质极少，边缘不整齐，云雾状，强嗜碱性或含有较多细小紫红色颗粒，常有不规则的毛状或小泡状突起，胞质无颗粒或颗粒极少。外形类似淋巴样小乌龟,核厚实，非轻飘飘的。

这类微巨核属于成熟巨核细胞，对于早期MDS诊断比较重要，是2或4倍体分裂的，说明它越接近干/祖细胞，而正常巨核是8倍体。

C 小圆核巨核

1-3个核，单圆核、双圆核。5q-综合征多见。

D 多圆核巨核

多个小核的大巨核细胞。不管单核或多核，都是核的不分叶，异常状态。

E 巨大或畸形血小板

多直径5um以上,外周血多见。

特别致谢天津血研所举办的MDS高级研修班的肖志坚教授和蔡文宇教授的讲课，特别致谢江苏省人民医院血液科实验室张建富教授的点滴教导！本篇作者学识有限，笔记积累及整理难免有不足和错误之处，配图为手机采集，清晰度不足，标注如有误差，恳请专家和老师们提出批评指正！

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